Ο Παράγοντας Ενεργοποίησης
Αιμοπεταλίων, PAF είναι ένα γλυκεριναιθερικό φωσφολιποειδές και
αποτελεί έναν από τους ισχυρότερους μεσολαβητές της αλλεργικής και
φλεγμονώδους αντίδρασης. Η βιοσύνθεσή του μπορεί να γίνει, είτε με
την de novo βιοσύνθεση των γλυκεριναιθέρων, είτε με την μετατροπή
πρόδρομων μεμβρανικών φωσφολιποειδώνμέσω της πορείας
αναχηματισμού. H αποικοδόμηση του PAF ξεκινά με την υδρόλυση της
ακετυλομάδας από την sn-2 θέση του γλυκερινικού σκελετού που οδηγεί
στον ανενεργό λυσο-PAF. Η παραγωγή αλλά και η αποικοδόμηση PAF έχει
παρατηρηθεί τόσο σε απομονωμένο νεφρικό ιστό όσο και σε νεφρικά
κύτταρα πειραματόζωων. Ο παραγόμενος στο νεφρό PAF έχει πλήθος
βιολογικών δράσεων και ενοχοποιείται ως ένας από τους μεσολαβητές
της νεφρικής βλάβης. Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η ταυτόχρονη
αναζήτηση και μελέτη των βιοσυνθετικών ενζύμων του PAF, de novo AT
και rem AT καθώς και του αποικοδομητικού του ενζύμου, PAF-AH σε
ανθρώπινο νεφρικό ιστό (φλοιό και μυελό). Οι νεφρικοί ιστοί
προήλθαναπό νεφρεκτομηθέντες ασθενείς με νεοπλασματική νεφρική
διεργασία και τα ένζυμα προσδιορίστηκαν με χημικές μεθόδους που
αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο. Διαπιστώθηκεενζυμική δραστικότητα rem
AT και de novo AT τόσο σε φλοιό όσο και σε μυελό ανθρώπινου
νεφρικού ιστού όπως πιστοποιήθηκε και από ανάλυση των προϊόντων των
ενζυμικών δοκιμασιών. Οι rem AT και de novo AT είναι μεμβρανικά
ένζυμα. To βέλτιστο pH δράσης της μικροσωμιακής rem AT είναι στην
περιοχή 7,4-7,7, ενώ της de novo AT είναι 8,4. Η rem AT
αναστέλλεται από συγκεντρώσεις BSA μεγαλύτερες των 0,5 mg/ml,
ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten με υποστρώματα τον λυσο-PAF και
το ακέτυλο-CoA, δείχνει εξειδίκευση για αιθερικά υποστρώματα,
εξαρτάταιαπό Ca2+,ενώ πειράματα με διάφορους αναστολείς έδειξαν
ότι για την δράση της απαιτεί μια ή περισσότερες ομάδες -SH. Το
ένζυμο αναστέλλεται ισχυρά από διάφορους γαλακτωματοποιητές αλλά
επιτεύχθηκε μικρό ποσοστό διαλυτοποίησης του ενζύμου (28 %) με
κατεργασία με γλυκερόλη. H de novo AT είναι ανεξάρτητη Ca2+,
απαιτεί ομάδες -S-S- για την δράσητης και δείχνει μέγιστη
δραστικότητα σε συγκέντρωση BSA 0,5 mg/ml. To προϊόν της δράσης
της, το ΑΑΡΑ, υδρολύεται ταχύτατα από φωσφοϋδρολάσες προς AAG. Τα
παραπάνω βιοχημικάχαρακτηριστικά διαφοροποιούν τις δύο ενζυμικές
δραστικότητες. Δεν φαίνεται να υπάρχει στατιστικώς σημαντική
διαφορά στην ειδική δραστικότητα της rem AT/de novo AT φλοιού και
μυελού. Η δραστικότητα της PAF-AH κατανέμεται στο κυτόπλασμα και
τις μεμβράνες αλλά δεν φαίνεται να υπάρχει διαφορά στις ιδιότητες
της μεμβρανικής και κυτοπλασματικής PAF-AH. Τέλος, αναπτύχθηκε
μέθοδος ομογενοποίησης νεφρικών βιοψιών για τον προσδιορισμό της
δραστικότητας rem AT και PAF-AH σε αυτές και προσδιορίστηκε η
δραστικότητα των ενζύμων στις πρώτες βιοψίες. Platelet Activating Factor, PAF, a
glyceryl-ether phospholipid, is one of the most potent mediators of
the allergic and inflammatory reactions. It is biosynthesized by
either the de novo biosynthesis of glyceryl ether lipids or by
remodelling of membrane phospholipids. Degradation of PAF proceeds
via cleavage of the acetyl group from the sn-2 position yielding
the biologically inactive lyso-PAF. PAF is synthesized and
catabolized by various renal cells and tissues and exerts a wide
range of biological activities on kidney tissue suggesting a
potential role for him during renal injury. The aim of this study
was to identify whether cortex and medulla of human kidney contains
the PAF biosynthetic activities of the rem AT and de novo AT as
well as the degradative activity of AH. Cortex and medulla were
obtained from nephrectomized patients with adenocarcinoma. The
enzymatic activities were determined by chemical methods developed
in our laboratory. Both acetyltransferase activities were detected
in cortex and medulla and distributed among the membrane
subcellular fractions. rem AT and de novo AT show optimal rates at
pH values of 7,4-7,7 and 8,4, respectively. rem AT is inhibited by
BSA at concentration over 0,5 mg/ml, it follows Michaelis-Menten
kinetics with both its substrates, lyso-PAF and Acetyl-CoA, it
prefers to act on substrates with an ether ether rather than ester
bond at the sn-1 position and its activity depends on the
availability of Ca2+ ions.Α -SH group is necessary for its
activity. The enzyme is strongly inhibited by various detergents
but we managed to solubilize 28% of it using glycerol as the
detergent. De novo AT activity is independent of Ca2+ but it
depends on the presence of -S-S- groups at its active center. It
shows optimalrates at BSA concentration of 0,5 mg/ml. AAPA, which
is the product of the de novo AT action, is rapidly hydrolyzed to
alkylacetylglycerol by phosphohydrolases. The different biochemical
characteristics of rem AT and de novo AT suggest that they are
discrete enzymes. There is no statistical difference between the
specific activities of rem AT/de novo AT of cortex and medulla. AH
is distributed between cytosol and membranes. There is no
difference between the biochemical properties of cytosolic and
membranous forms of AH. Finally, a novel method for the
homogenization of renal biopsies was developed in order to
determine the activity of both rem AT and AH at the
homogenate.
Trending Articles
More Pages to Explore .....